⊙作者：蒋超，黄璐琦，袁媛，陈敏

⊙编辑：小余

中医临床各科治病、预防疾病均需用药，辨证施治，理法方药，最后都落实在中药上。因此，历代医药学家非常重视中药材的质量，特别是药材的真假。“一物有谬，便性命及之”，药材真伪不仅与关乎治疗效果，而且还会关乎病人生命。性状、显微、理化、化学和生物鉴定构成了现代中药材鉴别方法的五大领域，其中以DNA分子标记为代表的生物鉴定方法已广泛应用于中药材分子真伪鉴别。

目前使用的DNA分子标记主要包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性(PCR-RFLP)、简单重复序列间区多态性（ISSR）、ITS序列分析、DNA条形码技术等。与传统鉴别方法相比，DNA分子标记不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制，其数量丰富、遗传稳定，对生物体的影响表现“中性”，即可以对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测；具有快速、微量、特异性强以及操作简便的特点。

与传统鉴别相比，分子鉴别也存在一些问题。如RAPD与ISSR的稳定性较差；PCR-RFLP需要进行酶切及电泳分析，实验步骤多、周期长；而DNA条形码技术等则需要测序仪等大型仪器，且对微量体积操作要求较高。另一方面，分子鉴定技术鉴别单个样品所需时间一般在2h以上，与TLC薄层色谱或显微鉴定20-30min即能获得检测结果相比，其鉴别周期明显延长，难以满足快速鉴别的要求，限制了分子鉴别的推广使用。

因此，挖掘和开发新的分子标记，尝试建立新方法，以满足中药材分子真伪鉴别准确、快速、高通量、低成本的要求，是一件任重而道远的工作。本文以药材金银花真伪鉴别为例，比较了表达序列标签-简单重复序列多态性（Expresssequencetag-simplesequencerepeat，EST-SSR）、聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性（polymerasechainreaction–restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）、位点特异性PCR（allele-specificPCR，AS-PCR）和环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）技术的原理、特点、检测方法以及检测时间和应用范围等，并针对各方法的缺陷提出相应的改进之处，以期筛选到适合金银花快速真伪鉴别的方法，也为其他中药材分子鉴别研究提供示范。

一、ESR-SSR

SSR又称微卫星，一般指1到6个核苷酸的短串联重复序列或2到8个核苷酸的串联重复。与其他分子标记相比，SSR具有分布广泛，共显性遗传，多态位点多，信息含量丰富，物种间转移性好，易于检测，重复性好的特点，在多种药材和作物中已用于遗传学的研究。

由于金银花基原植物忍冬与其主要伪品均属忍冬属植物，SSR分子标记在属的水平上具有良好的种间转移性，即同属植物利用忍冬SSR分子标记具有良好的通用性，因此通过比较忍冬及其混伪品间SSR重复次数差异有可能获得鉴别金银花及其混伪品的分子标记。本课题组通过EST来源的SSR引物jp.ssr4、jp.ssr64、jp.ssr65可准确鉴别金银花的原植物忍冬、变种红白忍冬，混伪品山银花的来源植物红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬，对于鉴定中药来源、保护中药原植物品种具有应用价值。

二、PCR-RFLP

PCR-RFLP又称CAPs(cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites)，是一种利用PCR扩增目的片段DNA，再使用特定的核酸内切酶消化扩增产物，直接通过凝胶电泳分辨DNA条带大小及多态性，从而检测酶切位点处是否发生突变的一种技术。由于该方法操作简单、特异性好、分型时间相对较短，在中药鉴定中具有重要作用，研究者先后使用PCR-RFLP对大黄、木通、泽泻、川贝母、人参等中药进行了分子鉴定。

由于大多数鉴别的分子标记均来自于ITS、18S等核基因序列或psbA-trnH、trnL-trnF、matK、rbcL等叶绿体片段，利用这些片段并通过序列比对，寻找药材真伪品间稳定的变异位点，分析变异位点是否位于内切酶识别序列上并导致了识别位点的改变，从而产生酶切图谱多态性。

忍冬属植物在NCBI数据库中已公开了16个备选DNA条形码的条序列，提供了丰富的DNA分子标记资源。通过序列比对，本课题组成功获得了2个金银花及其混伪品的鉴别位点，它们分别位于HinfI核酸内切酶及NlaIV核酸内切酶的识别位点上。由于金银花混伪品因序列变异导致识别位点丢失，因而无法被这两种内切酶切开。本课题组基于以上2个金银花与同属混伪品的特异性酶切位点多态性标记，建立了金银花类中药的PCR-RFLP鉴别方法。

三、位点特异性PCR

AS-PCR又称扩增阻滞突变系统，是年由Newton等人在PCR扩增的基础上发展的一种SNP分型方法，包括不引入错配的扩增阻滞突变系统和在引物3’端引入人为错配的位点特异性PCR。该方法原理为当野生型和突变型具有单碱基的变异时，将突变碱基设计于突变引物的3′端，引物与野生型完全匹配，与突变型在3′末端有一个碱基的不匹配。由于Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性，突变型延伸反应因磷酸酯键形成困难而受阻，扩增速度大为减弱。而野生型引物与模板DNA完全匹配，扩增时不受影响。扩增反应结束后，只有野生型得到有效扩增，从而在凝胶电泳图谱上呈现差异。位点特异性PCR只需要PCR进行PCR扩增，然后检测扩增产物的有无或扩增产物的量即可进行SNP分型，具有快速、简便的特点，已成功用于人参、陈皮、荆芥、藁本等中药材的真伪鉴别。

双向位点特异性PCR(BidirectionalPCRamplificationofspecificalleles，Bi-PASA)，是在位点特异性PCR的基础上发展出来的一种SNP分型方法，在单位点两侧设计引物，使得变异位点位于两引物的3’末端，分别扩增SNP位点两侧的核苷酸序列，两引物分别与野生型或突变型完全匹配，然后在两引物外侧设计与序列完全匹配的兼容引物，使得两对引物扩增长度不同，故而通过单次PCR扩增的产物长度差异即同时检测两种基因型。本课题组基于金银花及其混伪品叶绿体序列，筛选获得4个金银花鉴别的SNP位点，并建立了双向位点特异性PCR用于金银花真伪及混杂品鉴别方法。

四、环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（LAMP）是Notami等人在年提出的一种等温扩增新技术。其通过4引物识别目的基因的6个区域，使用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒温条件（60-65℃）下进行核酸的指数级扩增，通过在扩增反应中产生茎环结构引发下一轮引物结合，LAMP能在40-60min内把目的片段扩增到数量级，并且具有良好的序列特异性，在中药鉴定中具有良好的应用前景。由于LAMP技术是一种恒温扩增技术，只需要恒温加热槽即可满足实验要求，并且由于其扩增产物量大，加入染料后在紫外或可见光波段用肉眼判定颜色变化就可鉴别扩增反应的有无，非常有利于中药快速鉴别或现场鉴别，研究者利用该技术鉴别了人参、姜黄、长春花、虫草，白花蛇舌草等。

LAMP鉴别标记的来源广泛，包括：

（1）通用引物序列标记。Sasaki等通过使用18S或ITS序列的鉴别位点，设计LAMP引物，用于鉴别人参、姜黄等。

（2）多态性标记。Chaudhary等使用RAPD扩增长春花及其伪品，获得一个bp的长春花特有片段，利用该标记设计LAMP引物，成功鉴别了长春花及其伪品。

（3）功能基因标记。李奎等比对冬虫夏草及其常见伪品的Serine蛋白的核酸序列，开发成LAMP标记，用于鉴别冬虫夏草、亚香棒虫草、古尼虫草等常见虫草伪品。本课题组通过对序列进行分析，筛选获得trnL-trnF序列上的1个SNP位点用于设计LAMP引物，并初步建立了金银花及其混伪品的LAMP鉴别方法。

五、几种金银花分子鉴别方法的比较

本课题组已开发的4种金银花分子鉴别新方法主要基于PCR和LAMP扩增，其标记来源、检测方法、特点各有不同，导致在中药材分子鉴别中的应用情况也存在差异（表1）。

表1四种金银花分子鉴别方法的比较分析

表1四种金银花分子鉴别方法的比较分析（续表）

1.EST-SSR

（1）优点：EST-SSR多态位点多，信息含量高，可反映丰富的遗传变异信息，可用于近缘物种的鉴别。且SSR多通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行分型，成本较低。

（2）缺点：SSR标记大多通过文库构建或高通量测序获得，前期投入大。虽然可以使用磁珠吸附法获得SSR标记，但标记开发投入依然很大且后期也需要大量引物的筛选，不利于鉴别引物的开发。分型时聚丙烯酰胺凝胶电泳一般需要长达3h，且凝胶配制过程、银染过程均需要花费1h以上，不利于快速、高通量鉴定。虽然使用测序仪进行STR分型可以减少检测时间，但STR分型需要使用荧光标记引物，增加了鉴别成本。

2.PCR-RFLP

（1）优点：与EST-SSR相比，PCR-RFLP分子标记可通过比对公共数据库进行序列分析获得，成本低，且PCR-RFLP对DNA模板质量要求很低、稳定性好。对于药材来说，其DNA降解严重的情况非常适用。与RFLP相比，PCR-RFLP对用于进行鉴别材料的DNA量和DNA质量要求更低，仅需少量材料就可完成分型。

（2）缺点：PCR-RFLP非常依赖于内切酶的种类，要求鉴别位点正好位于内切酶的识别序列上，并导致识别位点的改变。然而由于限制性内切酶识别序列多为严格的回文序列，在序列中出现的概率不是很高，对于识别6碱基的内切酶来说，平均每个核苷酸才能遇到一个酶切位点。尽管有些内切酶识别序列具有简并性，如NlaIV识别序列为GGNN^CC（N=A/T/C/G），但内切酶的种类相对极少。限制性内切酶的主要生产公司销售的内切酶种类有限也是制约PCR-RFLP标记开发的主要因素。巢式PCR-RFLP虽然允许变异位点不在酶切位点上，但导致酶切后序列长度差异很小，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行片段分离，增加了操作步骤、延长了分型时间。

PCR-RFLP由于需要长时间酶切，导致分型时间一般在5h以上，不利于快速鉴别。新出现的快速作用内切酶，如FastDigest内切酶或QuickCutTM内切酶可以在5-15min内完成酶切反应，将有效缩短PCR-RFLP分型时间。

3.AS-PCR

（1）优点：由于单核苷酸多态性(SNP)在基因组水平上广泛存在，因其分布广泛、数量众多，双等位特性易于检测，常用来研究物种的起源与进化，进行物种的鉴定，在药材近缘种鉴别研究中具有重要意义。位点特异性PCR是一种基于SNP位点的基因分型方法，由于该方法只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分野生和突变的基因型，具有操作简单、快速的特点，非常有利于中药的快速鉴别。而在位点特异性PCR基础上发展出的双向等位基因特异性PCR仅通过单个SNP位点即可区分两种基因型，具有共显性、易于检测的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。位点特异性性PCR是一种基于PCR鉴别的方法，该方法只需要PCR扩增、凝胶电泳即可区分任意的SNP位点，非常适用于金银花与其伪品等近缘物种快速鉴别。并且，与PCR-RFLP相同，鉴别位点可以从公共数据库中开发，成本较少。在操作方面，该方法操作简单、鉴别快速，并且不需要大型仪器如测序仪等，与SSR及PCR-RFLP相比检测的灵活性有所增加。

（2）缺点：位点特异性PCR对SNP位点周围序列具有一定要求，并不是每一个位点均能通过位点特异性PCR进行SNP分型，其方法的建立主要取决于以下三个方面：

①由于位点特异性PCR引物序列严格依赖于SNP位点上下游序列，当位点周围序列AT含量过高、存在重复序列或可以形成严重发夹结构时，导致引物设计困难。

②在实验操作方面，引物筛选和实验条件优化过程较复杂。位点特异性PCR对反应条件要求严格，其退火温度、酶量、引物量、循环数、模板浓度、Taq酶种类都可能影响SNP分型结果，导致该方法应用推广过程中，如更换Taq酶或PCR仪时，需要重新调校退火温度。

③位点特异性PCR主要包括DNA提取、PCR扩增和凝胶电泳检测3个步骤，每个步骤均依赖大型仪器如离心机、PCR仪、凝胶成像系统等，对仪器的依赖性导致该方法便携性不够，无法用于田野或现场检测。

4.LAMP

（1）优点：环介导等温扩增技术是一种恒温扩增技术，与基于PCR的鉴别方法相比，LAMP法扩增量大，检测时间短，仅1-2小时内即可获得检测结果；且仪器要求宽松，不需要普通PCR所需的PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统，只要一个水浴锅就可完成检测反应，可进行现场检测；操作也较简单，整个过程不涉及复杂的仪器设备；检测结果清晰，只用肉眼观察颜色即可判断。与PCR鉴别一样，LAMP检测法鉴别标记来源广泛，真伪品差异位点均可开发成LAMP引物，非常适合中药的分子鉴别。

（2）缺点：主要包括以下3个方面：

①适合具有大片段或多位点差异物种的鉴别。对于近缘物种鉴别，由于其序列变异小，甚至只有单个核苷酸位点变异，难以进行LAMP引物设计。

②对实验条件要求严格，需要良好的控温措施。尤其是对近缘物种的鉴别，需要非常严谨的实验条件。如金银花与其同属伪品LAMP鉴别，温度需严格控制在65℃。

③LAMP引物对GC含量、Tm值、引物位置及序列GC含量均有很高要求，其开发相对PCR引物较难。由于LAMP使用4条引物识别6个区域，两个内引物长度一般均在40-50bp左右，容易形成强烈的引物二聚体，影响扩增效率，或产生假阴性、假阳性结果，引物筛选和实验条件的确定需要长时间的摸索才能建立。

六、展望

相对于传统经验鉴别、显微鉴别及理化鉴别来说，DNA分子鉴别技术准确度高，并且不受取样部位、发育时间、环境差异影响，可以对破碎中药甚至中成药进行鉴别，将会在中药真伪鉴别中起到越来越重要的作用。目前中药分子鉴定的主流是基于PCR技术的检测方法，与传统方法相比，PCR技术可以使用96孔板等进行大数目样品的并行检测，对于大量样品、破碎或粉末样品、微量或贵重样品、无特征成分样品的鉴定具有重要意义。PCR技术需要的主要仪器包括PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统或测序仪等，因便携性方面的缺点，DNA分子鉴别主要在实验室或药检部门进行。然而，随着中药商品化市场的扩大，医院药房、药市、种植基地等对中药分子鉴别提出了新的要求及挑战——即中药现场鉴别，由于抽检样品数目巨大，而现场鉴别的工作人员没有长时间的专业培训，鉴别方法选择必须考虑实验操作简单、步骤少、仪器依赖性低等因素。

位点特异性PCR、环介导等温扩增技术、DNA试纸条技术等通过条带有无进行鉴定的技术与荧光标记技术结合，通过颜色或发光强度进行鉴别将会在中药现场鉴别中起到越来越重要的作用。另一方面，恒温扩增技术如LAMP、解旋酶依赖的恒温扩增技术（HDA）,滚环扩增，重组酶扩增等只需要水浴锅或恒温加热槽即可进行鉴别，仪器依赖性低，操作简单，也逐渐显示出了在中药分子鉴定中的应用潜力。

参考文献：略。

[本文来源：《世界科学技术-中医药现代化》年16期。由中药大品种联盟（BBTCML）编校整理发表，转载请注明。]

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